✔ Sifat Spektroskopik Termal Asam Nukleat

(Tulisan Sifat Spektroskopik Termal Asam Nukleat adalah penggalan dari artikel dengan judul Tinjauan Asam Nukleat. Bila anda memerlukannya sebagai materi referensi, artikel tersebut bisa anda DOWNLOAD DISINI)

Sifat spektroskopik-termal asam nukleat mencakup kemampuan perembesan sinar UV, hipokromisitas, penghitungan konsentrasi asam nukleat, penentuan kemurnian DNA, serta denaturasi termal dan renaturasi asam nukleat. Masing-masing akan dibicarakan sekilas berikut ini.

Absorpsi UV

Asam nukleat sanggup mengabsorpsi sinar UV lantaran adanya basa nitrogen yang bersifat aromatik; fosfat dan gula tidak menunjukkan bantuan dalam perembesan UV. Panjang gelombang untuk perembesan maksimum baik oleh DNA maupun RNA ialah 260 nm atau dikatakan λmaks = 260 nm. Nilai ini terang sangat berbeda dengan nilai untuk protein yang memiliki λmaks = 280 nm. Sifat-sifat perembesan asam nukleat sanggup dipakai untuk deteksi, kuantifikasi, dan asumsi kemurniannya.

Hipokromisitas

Meskipun λmaks untuk DNA dan RNA konstan, ternyata ada perbedaan nilai yang bergantung kepada lingkungan di sekitar basa berada. Dalam hal ini, absorbansi pada λ 260 nm (A260) menunjukkan variasi di antara basa-basa pada kondisi yang berbeda. Nilai tertinggi terlihat pada nukleotida yang diisolasi, nilai sedang diperoleh pada molekul DNA rantai tunggal (ssDNA) atau RNA, dan nilai terendah dijumpai pada DNA rantai ganda (dsDNA). Efek ini disebabkan oleh pengikatan basa di dalam lingkungan hidrofobik. Istilah klasik untuk menyatakan perbedaan nilai absorbansi tersebut ialah hipokromisitas. Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik (kurang berwarna) kalau dibandingkan dengan ssDNA. Sebaliknya, ssDNA dikatakan hiperkromik terhadap dsDNA.

Penghitungan konsentrasi asam nukleat

Konsentrasi DNA dihitung atas dasar nilai A260-nya. Molekul dsDNA dengan konsentrasi 1mg/ml memiliki A260 sebesar 20, sedangkan konsentrasi yang sama untuk molekul ssDNA atau RNA memiliki A260 lebih kurang sebesar 25. Nilai A260 untuk ssDNA dan RNA hanya merupakan asumsi lantaran kandungan basa purin dan pirimidin pada kedua molekul tersebut tidak selalu sama, dan nilai A260 purin tidak sama dengan nilai A260 pirimidin. Pada dsDNA, yang selalu memiliki kandungan purin dan pirimidin sama, nilai A260 -nya sudah pasti.

Kemurnian asam nukleat

Tingkat kemurnian asam nukleat sanggup diestimasi melalui penentuan nisbah A260 terhadap A280. Molekul dsDNA murni memiliki nisbah A260 /A280 sebesar 1,8. Sementara itu, RNA murni memiliki nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Protein, dengan λmaks = 280 nm, tentu saja memiliki nisbah A260 /A280 kurang dari 1,0. Oleh lantaran itu, suatu sampel DNA yang menunjukkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan terkotori oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang menunjukkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkotori oleh protein.

Denaturasi termal dan renaturasi

Di atas telah disinggung bahwa beberapa senyawa kimia tertentu sanggup menyebabkan terjadinya denaturasi asam nukleat. Ternyata, panas juga sanggup menyebabkan denaturasi asam nukleat. Proses denaturasi ini sanggup diikuti melalui pengamatan nilai absorbansi yang meningkat lantaran molekul rantai ganda (pada dsDNA dan sebagian tempat pada RNA) akan menjelma molekul rantai tunggal. Denaturasi termal pada DNA dan RNA ternyata sangat berbeda. Pada RNA denaturasi berlangsung perlahan dan bersifat acak lantaran penggalan rantai ganda yang pendek akan terdenaturasi lebih dahulu daripada penggalan rantai ganda yang panjang.

Tidaklah demikian halnya pada DNA. Denaturasi terjadi sangat cepat dan bersifat koperatif lantaran denaturasi pada kedua ujung molekul dan pada tempat kaya AT akan mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya. Suhu saat molekul asam nukleat mulai mengalami denaturasi dinamakan titik leleh atau melting temperature (Tm). Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel DNA, dan berkisar dari 80 ºC sampai 100ºC untuk molekul-molekul DNA yang panjang. DNA yang mengalami denaturasi termal sanggup dipulihkan (direnaturasi) dengan cara didinginkan. Laju pendinginan besar lengan berkuasa terhadap hasil renaturasi yang diperoleh.

Pendinginan yang berlangsung cepat hanya memungkinkan renaturasi pada beberapa bagian/daerah tertentu. Sebaliknya, pendinginan yang dilakukan perlahanlahan sanggup mengembalikan seluruh molekul DNA ke bentuk rantai ganda ibarat semula. Renaturasi yang terjadi antara tempat komplementer dari dua rantai asam nukleat yang berbeda dinamakan hibridisasi.

Superkoiling DNA

Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler tertutup atau closedcircular (CC), contohnya DNA plasmid dan kromosom kuman serta DNA banyak sekali virus. Artinya, kedua rantai membentuk bundar dan satu sama lain dihubungkan sesuai dengan banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul DNA tersebut. Sejumlah sifat muncul dari kondisi sirkuler DNA. Cara yang baik untuk membayangkannya ialah menganggap struktur tangga berpilin DNA ibarat gelang karet dengan suatu garis yang ditarik di sepanjang gelang tersebut. Jika kita membayangkan suatu pilinan pada gelang, maka deformasi yang terbentuk akan terkunci ke dalam sistem pilinan tersebut. Deformasi inilah yang disebut sebagai superkoiling.

Interkalator

Geometri suatu molekul yang mengalami superkoiling sanggup berubah akhir beberapa faktor yang mempengaruhi pilinan internalnya. Sebagai contoh, peningkatan suhu sanggup menurunkan jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan kekuatan ionik sanggup menambah jumlah pilinan. Salah satu faktor yang penting ialah keberadaan interkalator ibarat etidium bromid (EtBr). Molekul ini merupakan senyawa aromatik polisiklik bermuatan positif yang menyisip di antara pasangan-pasangan basa. Dengan adanya EtBr molekul DNA sanggup divisualisasikan memakai paparan sinar UV.

Sumber http://zonabawah.blogspot.com

Share this post